~ Sterilisasi dalam Kultur Jaringan part 01~

Sterilisasi merupakan suatu upaya yang dilakukan teknisi agar daerah yang digunakan untuk memperbanyak tanamannya memiliki lingkungan yang aseptik.

Sterilisasi ada beberapa macam :

1. Sterilisasi Ruangan
2. Sterilisasi Alat
3. Sterilisasi Air
4. Sterilisasi Eksplan

1. Sterilisasi Ruangan

    Kesterilan ruangan merupakan faktor yang sangat mendukung dalam kesterilan media dan bahan yang akan ditransferkan. Oleh sebab itu, ada beberapa tahap untuk menjaga kesterilan, antara lain:

(a) Membersihkan ruangan dari sarang laba-laba dan debu yang menempel pada bagian atas ruangan, rak kultur, meja, bagian dalam serta bagian luar LAFC dan yang lainnya, lalu sapulah ruangan. Kemudian lap seluruh bagian tersebut menggunakan kain yang sudah di rendam air + Na-Hipoklorit 2 %. Peraslah kain tersebut hingga menjadi kain yang lembab agar tidak terlalu basah dan membuat noda pada bagian yang dibersihkan.

(b) Setelah menyapu dan membersihkan debu, biasakanlah mengepel lantai dengan larutan bayclean / Na-Hipoklorit 2 % hingga bersih.

(c) Semprotlah ruangan dengan alkohol 96 % secara merata setiap akhir pembersihan ruangan atau sesudah memakai ruangan tersebut.

2. Sterilisasi Alat

    Step A :

    Alat-alat (peralatan gelas, pinset, pipet tetes, dll; kecuali cutter/silet) yang akan dipergunakan untuk sterilisasi eksplan dan transfer eksplan dicuci dengan menggunakan air hangat + detergen cair, dan dibilas dengan air hangat beberapa kali, lalu di bilasan terahir menggunakan aquadest. Alat yang dipergunakan dibungkus dengan menggunakan kertas bersih lalu di masukkan kedalam oven. 

    Step B :

     Sterilisasi menggunakan autoklaf. Alat-alat yang akan disterilisasi dalam autoklaf, antaralain : Pinset, cutter / silet, botol kultur, aluminium foil, serta gelas ukur yang sudah di bungkus dengan kertas (kecuali pipet tetes) dimasukkan kedalam autoklaf selama 15 s/d 20 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 15 psi.

   Step C :

       Sterilisasi menggunakan oven. Alat-alat yang sudah diautoklaf dimasukkan ke dalam oven yang bersuhu 100oC (1 hari) atau 130oC - 170oC (2-4 jam).

3. Sterilisasi Air

      Botol yang akan digunakan untuk menyimpan aquadest harus tahan terhadap tekanan dan, terlebih dahulu di sterilisasi seperti sterilisasi alat (bag.2).  Lalu aquadest dimasukkan ke dalam botol dan ditutup dengan aluminium foil dan di autoklaf selama 30 - 40 menit dengan tekanan max 20 psi.

4. Sterilisasi Eksplan

    Sterilisasi eksplan berbagai macam caranya yang tergantung dengan jenis bahan eksplan tersebut apakah herbaceus atau kah berkayu. Jika herbaceus, lebih baik disterilisasi dengan keadaan terendam dalam konsentrasi yang optimal (tidak terlalu keras), jika terlalu keras akan mengakibatkan kematian jaringan. Apabila yang digunakan adalah jenis berkayu, maka lebih baik menggunakan konsentrasi yang lebih kuat karena dilihat dari ketahanannya tanaman berkayu lebih sulit untuk ditembus pensterilan dari luar dan tidak seperti herbaceus yang mudah mati jika menggunakan konsentrasi kuat.

NB : Herbaceus ==> bagian tanamannya lunak dan berair. contoh : tanaman jarak pagar, bayam

        Berkayu ==> bagian tanamannya keras dan lebih padat. 

Kontaminasi yang mendominasi pada kultur jaringan

     Tipe - tipe kontaminasi

Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Organisme-organisme tersebut secara universal terdapat pada jaringan tanaman. Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kondisi kering dan adanya organisme competitor menyebabkan mereka dalam kondisi terkontrol. Tapi, kondisi in vitro yang disukai eksplan, yaitu mengandung sukrosa dan hara dalam konsentrasi tinggi, kelembaban tinggi dan suhu yang hangat, juga disukai mikroorganisme yang seringkali tumbuh danberkembang sangat cepat, mengalahkan eksplan. 

·     Kontaminasi permukaan

Kontaminasi mungkin terjadi pada permukaan tanaman, antar sel atau dalam sel tanaman. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia (lihat minggu 11 untuk informasi detail). Keterbatasan utama adalah untuk memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk mengeliminasi kontaminasi tanpa merusak jaringan tanaman. Jika permukaan tanaman ditutupioleh rambut atau sisik, perhatian mesti diberikan untuk memastikan penetrasi bahan kimia, karena kontak dengan organisme sangat penting untuk sterilisasi. Ini biasanya dicapai dengan menambahkan detergen, agitasi (digoyang-goyang), atau membenamkan eksplan dengan sedikit tekanan untuk mengilangkan gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme. Perlakuan awal atau manajemen bahan tanaman dapat mengurangi jumlah kontaminasi dan karenanya mengurangi perlakuan dekontaminasi yang diperkukan dan tentu saja mengurangi resiko kerusakan jaringan eksplan. 

·      Sumber kontaminan

Eksplan awal merupakan sumber utama kontaminasi, tapi kontaminasi kembali dapat terjadi selama proses kultur. Pertama tama, media dan semua wadah dan alat harus disterilisasi. Semua kegiatan harus dilakukan pada kondisi higienis, meskipun tidak selalu perlu pada laboratorium yang steril. Udara merupakan sumber utama spora dan agen kontaminasi lainnya, termasuk badan dan pakaian teknisi.

·      Kontaminasi endogenus

Organisme yang hidup pada jaringan tanaman lebih susah ditangani. Hal ini mungkin dapat dikontrol dengan pemberian pestisida atau fungisida sistemik yang diberikan pada tanaman stok sebelum dijadikan eksplan atau dapat juga diberikan di kultur itu sendiri.

·      Eliminasi virus

Virus biasanya terdapat pada sel - sel jaringan tanaman dan ditransfer ke sel batu pada saat pembelahan sel, karenanya virus ditransfer ke tanaman anak (progeny) pada saat pembiakan vegetatif. Virus mungkin tidak menunjukkan gejala apapun pada saat tanaman dikulturkan, tapi akan tampak nantinya setelah tanaman di transfer ke lapang. Cara utama untuk mengeliminasi virus adalah dengan menggunakan terapi panas. Pada kondisi pertumbuhan normal, suatu virus akan ditransfer ke jaringan baru pada saat tunas baru tumbuh. Jika tanaman dapat ditumbuhkan pada suhu tinggi, adalah memungkinkan untuk memperlambat kecepatan replikasi virus sehingga ujung tunas dapat tumbuh lebih dulu sebelum terkontaminasi. Ujung tunas dapat kemudian dapat dipindahkan dan tumbuh bebas virus. Biasanya perlu untuk menguji pertumbuhan selanjutnya untuk memastikan tanaman bebas virus. Perlakuan panas dapat diaplikasikan pada tanaman normal, namun suhu yang diperlukan (misalnya 39^oC selama 7 hari) seringkali mematikan bagi tanaman. Tunas in vitro mungkin lebih dapat bertahan terhadap perlakuan ini.

·      Media awal

Biasanya dignakan media dasar dengan sukrosa tanpa penambahan hormon untuk penanaman eksplan awal. Ini menghindari pemborosan media dimana sebagian kultur biasanya akan terkena kontaminasi ataumati akibat perlakuan awal. Kebanyakan kontaminasi jamur atau bakteri akan terjadi pada 2 minggu pertama.Pada beberapa contoh, pestisida mungkin dimasukkan pada media awal atau sukrosa mungkin dihilangkan agar eksplan dapat tumbuh tanpa terkontaminasi. Tanaman yang baru tumbuh ini lalu dapat dipindah dengan hati - hati dengan cara mensubkultur. Perhatian juga mesti diberikan pada ruang persiapan kultur, untuk menghindari kontaminasi.

·      Eksudat

Tipe lain kontaminasi adalah eksudasi dair eksplan, bukan dari organisme lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara pemotongan atau perlakuan bahan kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi pada sel sekitar luka. Salah satu prosesnya adalah produksi bahan biokimia apakah sebagai produk pecahan atau sintesa sebagai mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi dari jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini mungkin atau mungkin tidak memberi pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur. Dengan cara mencuci eksplan sebelum penanaman dan menghindarai desikasi dapat mengurangi reaksi luka tapi beberapa spesies masih memproduksi eksudat. Mungkin perlu untuk mentransfer eksplan kemedia segar/baru secara teratur pada minggu awal kultur untuk menghilangkan eksudat. Pada kasus lain, tambahan bahan kimia mungkin digunakan untuk menyerap eksudat. Adsorbent misalnya arangaktif, PVP (polyvinylpyrrolidine). Agen anti-oksidising seperti asam askorbat, asam sitrat atau sistein mungkin dapat mengurangi atau mencegah produksi eksudat, terutama senyawa fenolik. Perendaman ekplan pada air steril 50^oC selama 5 s/d 15 menit berhasil mengatasi produksi eksudat pada beberapa tanaman asli Australia. Produksi eksudat gelap pada Eucalyptus, dapat dikurangi dengan menempatkan kultur dalam gelap selama beberapa hari. Bahan kimia lain yang tidak tampak tapi memiliki pengaruh nyata adalah gas etilen. Etilen diproduksi secara alami pada jaringan tanaman dan memegang peran penting pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman normal. Seringkali diproduksi sebagai akibat stress pada tanaman, seperti pelukaan atau desikasi jaringan. Etilen mungkin terakumulasi pada wadah kultur dan mempengaruhi eksplan. Gejalanya meliputi layu daun dan nekrosis daun.

·      Kondisi kultur

Tipe substrat hampir semua kultur dilakukan pada media semi-solid (semi-padat) dengan menggunakan agar atau Gelrite. Gel ini menjadi pendukung fisik untuk eksplan dan meningkatkan aerasi pada media. Gelrite adalah produk sintetik yang memiliki keuntungan gel yang lebih jernih dibandingkan agar yang agak keruh (dari ekstrak rumput laut). Gelrite membuat pengamatan kontaminan atau perkembangan akar lebih mudah. Gelrite memiliki kondisi fisik dan kimia yang sedikit berbeda sehingga memerlukan sedikit modifikasi pada persiapan media. Media cair seringkali digunakan untuk kultur kalus atau sel, dimana jaringan harus dibenamkan pada media untuk menghindari kekeringan. Penggoyangan pada media perlu dilakukan untuk mendapatkan aerasi dan distribusi larutan hara yang merata. Penggoyangan yang cukup keras dapat dilakukan untuk memisahkan sel-sel atau kumpulan kalus.

Eksplan mungkin harus disuspensikan pada media cair dengan menggunakan jembatan yang dibuat dari kertas saring atau Sorba rods. Tipe substrat dapat mempengaruhi tipe pertumbuhan dan perkembangan yang terjadi, misalnya morfologi akar.

·      pH media

pH media biasanya diatur 5,5 pada saat persiapan. pH media dapat memepngaruhi kelarutan hara. pengambilan hara oleh tanaman dalam kultur dan pembekuan agar atau pengaruh terhadap morfologi. Satu hal yang selalu diabaikan adalah perubahan pH pada media akibat proses pemanasan dengan autoklaf.

·           Lingkungan

Faktor lingkungan tuama untuk kultur adalah cahaya dan suhu, karena tingkat kelembaban terpelihara dalam wadah tertutup. Umumnya kultur disimpan pada suhu ruang, misalnya 20-25^oC. Cahaya disuplai dengan lampu neon, memberikan kira-kira 30-50mol m^-2s^-1 irradiasi pada kultur. Iradiasi yang relative rendah ini cukup untuk respon morfologi normal tapi tidak cukup untuk fotosintesis yang mana ini berjumlah penting karena sukrosa masih diberikan pada media. Fotoperiode atau panjang hari biasanya 12-16 jam, kadang-kadang 24 jam. Tempat yang cukup ternaung dalam rumah kaca atau dekat jendela kamar dapat menjadi ruang kerja rutin skala kecil.

·      Pengamatan dan transfer

Kultur awal mungkin terkontaminasi, kultur lain mungkin rusak akibat proses persiapan dan disinfestasi. Ini akan tampak dalam 2 minggu pertama kultur. Eksplan yang selamat kemudian dapat ditransfer ke kultur yang mengandung media kompleks. Jika produksi eksudat menjadi masalah, beberapa kali transfer kemedia dasar baru mungkin diperlukan selama periode pengembangan. Kultur tunas mungkin menghasilkan perpanjangan tunas selama masa awal ini dan tunas ini dapat dipotong pada saat transfer ke media baru.

Kultur Jaringan (Tissue Culture)

Kultur jaringan merupakan suatu upaya yang dilakukan dalam mengisolasi bagian tanaman yang kemudian
akan dikulturkan dalam media yang aseptik.

Manfaat kultur jaringan :
1. Untuk menghasilkan tanaman yang sifatnya identik dengan indukan ataupun sifat yang diinginkan.
2. Menghindari adanya cekaman hama dan penyakit dalam fase remaja.

3. Mampu menghasilkan bibit unggul dalam waktu yang relatif singkat.
4. Dapat memproduksi sepanjang tahun.
5. Pelestarian plasma nutfah.
6. Mampu memperbanyak tanaman yang sulit diperbanyak secara vegetatif konvensional.
7. Keseragaman genetik.

          Kultur jaringan prinsip dasarnya didasari oleh adanya teori TOTIPOTENSI SEL, yang menyatakan bahwa setiap mahluk hidup memiliki potensi genetik untuk menghasilkan organisme lengkap. Ekspresi yang ditunjukkan oleh totipotensi sel terhadap tanaman pada umumnya mengacu pada pengaruhnya hormon pertumbuhan yang berkerja dalam tubuh tumbuhan.

Kinerja dari hormon yang ada pada tanaman dipengaruhi oleh faktor lingkungan media yang akan dipergunakan dalam kultur jaringan. Adapula beberapa zat pengatur tumbuh yang dapat membantu kinerja hormon dalam tubuh tanaman yaitu : Giberelin (GA), Asam Absisat (ABA), Auksin, Sitokinin, dan Etilen.

Ketika tanaman dikulturkan, jaringan tanaman mengalami perubahan yang disebut dengan "Situasi Krisis". Hal tersebut terjadi diakibatkan karena adanya kekurangan suplai air, mineral, dan hasil kinerja karbohidrat yang bersimulasi akan menghasilkan energi bagi tanaman.Sehingga ketika ingin melakukan kultur, maka diwajibkan membuat media yang memiliki unsur hara, air serta karbohidrat yang sesuai dengan kebutuhan tanaman tersebut.

Tahap-tahap pelaksanaan kultur jaringan:

1. Sterilisasi Ruangan dan Alat

2. Pembuatan Media

3. Persiapan dan Sterilisasi Eksplan

4. Penanaman Eksplan

5. Inkubasi