Kontaminasi yang mendominasi pada kultur jaringan

     Tipe - tipe kontaminasi

Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Organisme-organisme tersebut secara universal terdapat pada jaringan tanaman. Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kondisi kering dan adanya organisme competitor menyebabkan mereka dalam kondisi terkontrol. Tapi, kondisi in vitro yang disukai eksplan, yaitu mengandung sukrosa dan hara dalam konsentrasi tinggi, kelembaban tinggi dan suhu yang hangat, juga disukai mikroorganisme yang seringkali tumbuh danberkembang sangat cepat, mengalahkan eksplan. 

·     Kontaminasi permukaan

Kontaminasi mungkin terjadi pada permukaan tanaman, antar sel atau dalam sel tanaman. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia (lihat minggu 11 untuk informasi detail). Keterbatasan utama adalah untuk memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk mengeliminasi kontaminasi tanpa merusak jaringan tanaman. Jika permukaan tanaman ditutupioleh rambut atau sisik, perhatian mesti diberikan untuk memastikan penetrasi bahan kimia, karena kontak dengan organisme sangat penting untuk sterilisasi. Ini biasanya dicapai dengan menambahkan detergen, agitasi (digoyang-goyang), atau membenamkan eksplan dengan sedikit tekanan untuk mengilangkan gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme. Perlakuan awal atau manajemen bahan tanaman dapat mengurangi jumlah kontaminasi dan karenanya mengurangi perlakuan dekontaminasi yang diperkukan dan tentu saja mengurangi resiko kerusakan jaringan eksplan. 

·      Sumber kontaminan

Eksplan awal merupakan sumber utama kontaminasi, tapi kontaminasi kembali dapat terjadi selama proses kultur. Pertama tama, media dan semua wadah dan alat harus disterilisasi. Semua kegiatan harus dilakukan pada kondisi higienis, meskipun tidak selalu perlu pada laboratorium yang steril. Udara merupakan sumber utama spora dan agen kontaminasi lainnya, termasuk badan dan pakaian teknisi.

·      Kontaminasi endogenus

Organisme yang hidup pada jaringan tanaman lebih susah ditangani. Hal ini mungkin dapat dikontrol dengan pemberian pestisida atau fungisida sistemik yang diberikan pada tanaman stok sebelum dijadikan eksplan atau dapat juga diberikan di kultur itu sendiri.

·      Eliminasi virus

Virus biasanya terdapat pada sel - sel jaringan tanaman dan ditransfer ke sel batu pada saat pembelahan sel, karenanya virus ditransfer ke tanaman anak (progeny) pada saat pembiakan vegetatif. Virus mungkin tidak menunjukkan gejala apapun pada saat tanaman dikulturkan, tapi akan tampak nantinya setelah tanaman di transfer ke lapang. Cara utama untuk mengeliminasi virus adalah dengan menggunakan terapi panas. Pada kondisi pertumbuhan normal, suatu virus akan ditransfer ke jaringan baru pada saat tunas baru tumbuh. Jika tanaman dapat ditumbuhkan pada suhu tinggi, adalah memungkinkan untuk memperlambat kecepatan replikasi virus sehingga ujung tunas dapat tumbuh lebih dulu sebelum terkontaminasi. Ujung tunas dapat kemudian dapat dipindahkan dan tumbuh bebas virus. Biasanya perlu untuk menguji pertumbuhan selanjutnya untuk memastikan tanaman bebas virus. Perlakuan panas dapat diaplikasikan pada tanaman normal, namun suhu yang diperlukan (misalnya 39^oC selama 7 hari) seringkali mematikan bagi tanaman. Tunas in vitro mungkin lebih dapat bertahan terhadap perlakuan ini.

·      Media awal

Biasanya dignakan media dasar dengan sukrosa tanpa penambahan hormon untuk penanaman eksplan awal. Ini menghindari pemborosan media dimana sebagian kultur biasanya akan terkena kontaminasi ataumati akibat perlakuan awal. Kebanyakan kontaminasi jamur atau bakteri akan terjadi pada 2 minggu pertama.Pada beberapa contoh, pestisida mungkin dimasukkan pada media awal atau sukrosa mungkin dihilangkan agar eksplan dapat tumbuh tanpa terkontaminasi. Tanaman yang baru tumbuh ini lalu dapat dipindah dengan hati - hati dengan cara mensubkultur. Perhatian juga mesti diberikan pada ruang persiapan kultur, untuk menghindari kontaminasi.

·      Eksudat

Tipe lain kontaminasi adalah eksudasi dair eksplan, bukan dari organisme lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara pemotongan atau perlakuan bahan kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi pada sel sekitar luka. Salah satu prosesnya adalah produksi bahan biokimia apakah sebagai produk pecahan atau sintesa sebagai mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi dari jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini mungkin atau mungkin tidak memberi pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur. Dengan cara mencuci eksplan sebelum penanaman dan menghindarai desikasi dapat mengurangi reaksi luka tapi beberapa spesies masih memproduksi eksudat. Mungkin perlu untuk mentransfer eksplan kemedia segar/baru secara teratur pada minggu awal kultur untuk menghilangkan eksudat. Pada kasus lain, tambahan bahan kimia mungkin digunakan untuk menyerap eksudat. Adsorbent misalnya arangaktif, PVP (polyvinylpyrrolidine). Agen anti-oksidising seperti asam askorbat, asam sitrat atau sistein mungkin dapat mengurangi atau mencegah produksi eksudat, terutama senyawa fenolik. Perendaman ekplan pada air steril 50^oC selama 5 s/d 15 menit berhasil mengatasi produksi eksudat pada beberapa tanaman asli Australia. Produksi eksudat gelap pada Eucalyptus, dapat dikurangi dengan menempatkan kultur dalam gelap selama beberapa hari. Bahan kimia lain yang tidak tampak tapi memiliki pengaruh nyata adalah gas etilen. Etilen diproduksi secara alami pada jaringan tanaman dan memegang peran penting pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman normal. Seringkali diproduksi sebagai akibat stress pada tanaman, seperti pelukaan atau desikasi jaringan. Etilen mungkin terakumulasi pada wadah kultur dan mempengaruhi eksplan. Gejalanya meliputi layu daun dan nekrosis daun.

·      Kondisi kultur

Tipe substrat hampir semua kultur dilakukan pada media semi-solid (semi-padat) dengan menggunakan agar atau Gelrite. Gel ini menjadi pendukung fisik untuk eksplan dan meningkatkan aerasi pada media. Gelrite adalah produk sintetik yang memiliki keuntungan gel yang lebih jernih dibandingkan agar yang agak keruh (dari ekstrak rumput laut). Gelrite membuat pengamatan kontaminan atau perkembangan akar lebih mudah. Gelrite memiliki kondisi fisik dan kimia yang sedikit berbeda sehingga memerlukan sedikit modifikasi pada persiapan media. Media cair seringkali digunakan untuk kultur kalus atau sel, dimana jaringan harus dibenamkan pada media untuk menghindari kekeringan. Penggoyangan pada media perlu dilakukan untuk mendapatkan aerasi dan distribusi larutan hara yang merata. Penggoyangan yang cukup keras dapat dilakukan untuk memisahkan sel-sel atau kumpulan kalus.

Eksplan mungkin harus disuspensikan pada media cair dengan menggunakan jembatan yang dibuat dari kertas saring atau Sorba rods. Tipe substrat dapat mempengaruhi tipe pertumbuhan dan perkembangan yang terjadi, misalnya morfologi akar.

·      pH media

pH media biasanya diatur 5,5 pada saat persiapan. pH media dapat memepngaruhi kelarutan hara. pengambilan hara oleh tanaman dalam kultur dan pembekuan agar atau pengaruh terhadap morfologi. Satu hal yang selalu diabaikan adalah perubahan pH pada media akibat proses pemanasan dengan autoklaf.

·           Lingkungan

Faktor lingkungan tuama untuk kultur adalah cahaya dan suhu, karena tingkat kelembaban terpelihara dalam wadah tertutup. Umumnya kultur disimpan pada suhu ruang, misalnya 20-25^oC. Cahaya disuplai dengan lampu neon, memberikan kira-kira 30-50mol m^-2s^-1 irradiasi pada kultur. Iradiasi yang relative rendah ini cukup untuk respon morfologi normal tapi tidak cukup untuk fotosintesis yang mana ini berjumlah penting karena sukrosa masih diberikan pada media. Fotoperiode atau panjang hari biasanya 12-16 jam, kadang-kadang 24 jam. Tempat yang cukup ternaung dalam rumah kaca atau dekat jendela kamar dapat menjadi ruang kerja rutin skala kecil.

·      Pengamatan dan transfer

Kultur awal mungkin terkontaminasi, kultur lain mungkin rusak akibat proses persiapan dan disinfestasi. Ini akan tampak dalam 2 minggu pertama kultur. Eksplan yang selamat kemudian dapat ditransfer ke kultur yang mengandung media kompleks. Jika produksi eksudat menjadi masalah, beberapa kali transfer kemedia dasar baru mungkin diperlukan selama periode pengembangan. Kultur tunas mungkin menghasilkan perpanjangan tunas selama masa awal ini dan tunas ini dapat dipotong pada saat transfer ke media baru.